稳转细胞株构建全攻略：从理论到实践的生物制药核心技术解析

为何稳转细胞株成为生物制药领域的“兵家必争之地”？

稳转细胞株被称为“药物研发的基石”，是单克隆抗体、双抗、疫苗、ADC等生物制品规模化生产的核心环节，还是药物生产成本、效率和质量的关键决定因素。一株高产稳定的细胞株有可能直接缩短药物上市周期3-5年。稳定细胞株因其稳定性高，适用于各种研究应用，包括重组蛋白、抗体生产、结构生物学和功能性研究等。

那么，如何打造一株理想的稳转细胞株呢？

义翘神州在重组表达方面不断深耕，积累了大量稳定株开发的相关经验，在提高稳定细胞株的生产能力、改善细胞状态等方面有着丰富的经验。义翘神州可提供从基因合成到稳定细胞株交付的一站式服务，为客户的研究提供助力。

稳转细胞株是指在细胞中持续稳定表达特定基因或者干扰特定基因表达的细胞株。与瞬时转染相比，稳转细胞株便于长期观察基因对于细胞功能的影响及蛋白相互作用，尤其适合于体内实验。稳转细胞株将外源基因克隆至含有某种筛选标记的载体上，将载体转染目的细胞并整合到染色体中，利用载体携带的筛选标记进行筛选，从而得到可稳定表达目的基因的细胞株。

稳转细胞株的构建通常包含：载体构建、转染、Pool筛选、克隆筛选、PCB建库、MCB/WCB建库、细胞株稳定性研究等内容。

生产用稳转细胞株的构建从表达载体构建和细胞转染开始。

转染过程是将表达目的蛋白的基因整合到载体中，再将该载体转染至宿主细胞内。表达水平与基因拷贝数、基因整合位点的转录活性有关。常用的转染方式有钙转、电转、脂质体转染、逆转录病毒转染等。

常用的宿主细胞是CHO。CHO细胞种类多样，包括CHO-K1、CHO-S、CH-DG44、CHOZN-GS、CHO-K1SV、CHO-K1SV GS-KO、CHO-K1 GS等。不同的CHO宿主细胞在细胞株构建中的表现各异。

接着，采用不同的筛选试剂获得正确高效表达目的基因的细胞池（Pool）。

为了更高效地筛选出高表达水平的稳转细胞株，表达载体上除了包含蛋白本身的基因以外，往往还含有各种筛选标记。筛选标记一般可以被分为两大类：一类是以G418为代表的抗生素类筛选标记；另一类是以MTX为代表的细胞代谢筛选标记。

不同种类的筛选标记（源自文献：DOI: 10.4161/mabs.2.5.12720）

当目的基因被转染到宿主细胞内，按照一定的细胞密度在合适的筛选压力下进行传代培养后便可获得细胞池（Pool）。针对不同的宿主细胞可以采取不同的Pool筛选方式。例如：采用摇瓶进行大规模Pool筛选，或采用孔板进行迷你Pool筛选。Pool的表达量取决于转染的方式、筛选压力以及目的基因整合情况。

对于不同的目的蛋白分子，在Pool阶段需要考察的标准不同。例如：对于常规新药抗体，往往表达量为评价标准；对于生物类似物，在Pool阶段则需着重考察各项质量参数与原研药的差异；对于双特异性抗体，在此阶段需开始考察正确装配的比例，以期降低克隆筛选阶段的风险。

细胞池Pool中的每个细胞特性各异，具有不同的基因整合位点、拷贝数、生长速率等，需将其中具有高产、稳定表达特性的细胞个体分离出来分别加以富集培养，获得数百甚至上千的候选克隆供筛选。

后，单克隆筛选是关键操作步骤。

通常采用以下组合形式筛选单克隆，确保单个细胞形成单克隆：

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【参考文献】

1.  Feng Li, et al. Cell culture processes for monoclonal antibody production. mAbs, 2010. DOI: 10.4161/mabs.2.5.12720

2. Noh, et al. Comprehensive characterization of glutamine synthetase-mediated selection for the establishment of recombinant CHO cells producing monoclonal antibodies. Sci Rep, 2018. -0