动物二级生物安全实验室与二级生物安全实验室核心区应分开设置；不同品种的实验动物以及不同病原微生物处理的动物不应在同一个房间饲养，应分设不同的饲养间。加强型与普通型动物二级生物安全解剖取材室应分开设置。普通级大动物检疫间与动物饲养区应分开设置，不同级别的实验动物应分区饲养，不应同时在一个房间饲养不同种属的实验动物，发出较大噪声的动物和对噪声敏感的动物宜分区设置。屏障环境开间在满足实验动物前提下应满足功能最大化的需要，屏障环境内应布置必要的实验动物生产和使用设备。加强型动物二级生物安全实验室工艺布局要求，加强型动物二级生物安全实验室的区域划分应切实遵循物理隔离的建筑技术原则，应根据实验对象和工艺要求划分为动物实验室核心工作区（以下简称污染区）、动物实验室辅助工作区（以下简称半污染区）和动物实验室辅助用房（以下简称清洁区），污染区、半污染区、清洁区之间应设缓冲室。动物实验室污染区指防护区中从事活体动物病原微生物及样本操作的区域，包括动物饲育（操作）室、实验室工作站（解剖取材室）；通过灭菌器、传递舱、缓冲间与半污染区相连。动物实验室半污染区指防护区以外的区域，包括洁物储藏室、洗刷间、灭菌前废弃物品存放间等；通过灭菌器、传递舱、缓冲间与污染区和洁净区相连。动物实验室清洁区，实验动物隔离检疫室、更衣室、机械设备室、淋浴间、密闭式实验动物尸体冷藏存放间（区）、办公室、维护室、库房、饲料室、一般走廊应通过缓冲间与半污染区相连。
加强型动物二级生物安全实验室分区时隔离屏蔽的要求，应设防止昆虫进入的屏障；至少在所有外部出入口处要设置屏障，防实验动物外逃，防逃逸屏障高度不低于40cm。设施空间的柱网、层高应选用适应性强、灵活性大的布置方式。宜设双走廊或三走廊，走廊宽度不应小于1.5m，门宽应满足动物饲育设备进出要求。加强型动物二级生物安全实验室废弃物处理应以建筑物垂直布局按上、中、下三层设计为宜，即：废弃物处理区位于动物实验核心区下方为宜，主要有液体废物收集管道、液体废弃物处理设备和固体废弃物处理设备（固废、液废污染物生物安全型高压灭菌设备，流动式加热灭菌设备或固废、实验动物尸体、标本焚烧炉等）。为了防止意外流露造成的生物安全事件，液废、固废处理空间的压力为-10Pa，气流方式和气密性要求与三级生物安全实验室相同。动物实验室工作区位于中间区域为宜，包括支持区（饲垫料准备区、去污、灭菌区）、动物二级生物安全动物饲育（操作）室、解剖取材室、兽医室、灭菌器、传递舱、缓冲间等。空气处理区此区无生物安全防护要求，原则上要远离动物实验区，减少噪声、振动对实验动物的影响。加强型动物二级生物安全实验室各专业设计、建造均参照三级生物安全实验室要求；操作对象和操作者之间的隔离通过生物安全装备等防护设施来实现。