作为生命的种子,干细胞在生物界叱咤风云已久,是目前公认的明日之星。
从“多利”绵羊的诞生,到诱导性多能干细胞(iPSC)的发现。
再到现如今,无论是疾病模型,细胞治疗还是器官移植再生医学方面的突飞猛进,都让我们始终相信干细胞治疗的愿景终将实现。
当然,突飞猛进的现况,离不开干细胞基础和临床研究这些星星之火。
干细胞的分离和鉴定,则是众多干细胞基础研究和临床研究的基础和根本,也是研究结果可信度判定关键核心步骤之一。
干细胞的特征是多向分化能力以及多代增殖能力,其鉴定主要依据其在形态特征、细胞成分与结构、基因修饰与表达差异、生长特性、表型标志、体内外分化潜能等方面与成熟细胞的差异,从概念上讲,干细胞的*基本特征是自我更新能力和多向分化潜能,增殖能力是考察干细胞活性的重要依据,而在体内外是否能够向多种类型的成熟细胞分化则是认定干细胞的“金标准”。
干细胞的鉴定主要从形态学和功能学两方面来进行。
形态学方面的鉴定包括表面形态、表面标记分析—流式鉴定(FACS)、免疫组化等。
功能学方面的鉴定主要包括增殖能力(自我更新能力)和分化能力(成骨诱导分化,成脂诱导分化,成软骨诱导分化)等鉴定。
飞凡检测检测指标
1、肿瘤干细胞(飞凡检测)
肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells, CSCs),也被称为肿瘤启动细胞(tumor initiating cell ,TICs),被认为是肿瘤组织内有自我更新、高致瘤性, 分化潜能等特征的一个小细胞亚群(1%-5%),是维持肿瘤生长的核心,通过与肿瘤微环境相互作用,CSCs可维持自身的可塑性,同时促进肿瘤发生、发展、侵袭、转移等过程。
肿瘤干细胞靶向治疗及研究的前提条件是CSCs鉴定及有效的分离,CSC的鉴定包括以下几种方式:
(1)体内致瘤实验,将CSC接种于免疫缺陷动物, 经过一段时间培养, 观察免疫缺陷动物肿瘤生长情况.;其中异体移植实验被认为是鉴定CSC的金标准;
(2)体外克隆实验;普通肿瘤细胞在有限次传代后便会死亡;CSC因其有极强的自我更新及无限增殖功能, 能连续传代;
(3)传代培养,CSC有多向分化能力, 在体外培养时, CSC向普通肿瘤细胞分化, *终失去分化能力;
(4)ALDH1、Hoechst33342染料法等;
(5)根据表面标志物进行流式鉴定及分选。
表一:不同肿瘤中的CSCs的表面标志物(飞凡检测)
受肿瘤环境、分离、培养等条件影响,使用表面标志物进行肿瘤干细胞的鉴定需要考虑诸多因素:1. 肿瘤标志物的选择:肿瘤发展到不同时期,表面标志物表达水平在不同微环境中, 由于各种生长因子的影响, 或是其他影响因素可致其发生动态变化;而已分选出的CSC在体外培养条件下也可能发生显著的表型变化;
2. 一种类型的CSC标志物不能用于鉴定其他类型的CSC;
3. 有些表面标志物对酶消化敏感,而实体肿瘤的CSCs鉴定及分离必须经过酶消化;可以使用Ca2+螯合的EDTA替代胰酶消化。
此外,有文章中作者提到其实验室在清洗步骤时使用了预冷不含Ca2+的PBS作为清洗液,接着使用含有2mM EDTA的PBS孵育并在全培养基中用枪吹打解离,这些尝试对于解离哺乳动物细胞系是比较有效的[9];
4. EDTA长时间孵育会导致细胞聚集,对于不同的细胞系其解离时的孵育时间需要分别优化;