检测技术服务:蛋白质质谱鉴定技术的原理与应用--检测技术服务详情
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质谱具有灵敏度高、准确度高的特点，能够准确、快速地鉴定蛋白质。传统的质谱技术早期受限于分析小分子物质。随着基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）等新电离技术的出现和发展，为准确和快速鉴定蛋白质等大分子创造了便利条件。目前，蛋白质的酶解、液相色谱分离肽、串联质谱分析肽氨基酸序列、质谱数据分析相结合已成为蛋白质鉴定的shǒu选方案。本文主要讨论了蛋白质质谱鉴定的原理和应用。
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱MALDI-TOF
MALDI-TOF MS的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，基质分子通过辐射吸收的能量导致能量积累并迅速产生热量，从而使基质晶体升华。这导致基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI产生的质谱多为单电荷离子，因此质谱中离子的质量与肽和蛋白质的质量之间存在一一对应关系。MALDI产生的离子通常由飞行时间（TOF）检测器检测。理论上，只要飞行管的长度足够长，TOF检测器可以检测到的分子质量没有上限。因此，MALDI-TOF质谱仪适用于蛋白质、肽和其他生物大分子的研究。
MALDI-TOF-MS技术的特点
MALDI-TOF鉴定方便快捷，可同时做数百个斑点。
主要用于纯蛋白质或简单样品的鉴定，如2DE斑点。
成本更低。
样品要求
蛋白质溶液：纯度>90%，总蛋白质>5 ug，浓度>0.1 ug/ul。
二维凝胶电泳斑点：考马斯亮蓝染色斑点和银染色斑点清晰可见。
SDS-PAGE条带：考马斯亮蓝染色条带和银染色条带清晰可见。
电喷雾电离质谱ESI-MS
电喷雾电离（ESI）是质谱分析中用电喷雾产生离子的一种技术，在电喷雾中向液体施加高压产生气溶胶。它特别适用于从大分子中产生离子，因为它克服了这些分子在电离时碎裂的倾向。电喷雾电离的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，这将质荷比降低到大多数质谱仪可以检测到的范围，从而大大扩展了分子量分析范围。离子的真实分子量也可以根据电荷比和电荷数计算出来。
ESI-MS技术的特点
高通量：一次可鉴定数十至数百种蛋白质。
高灵敏度：可检测极低浓度的样品。
用途广泛：分析蛋白质条带、免疫共沉淀洗脱产物、组织提取物、全细胞裂解物、亚细胞级分和其他样品。
样品要求
蛋白质溶液：总蛋白质>5ug，浓度>0.1ug/ul。缓冲液不含洗涤剂NP40、Triton X-100等。
SDS-PAGE条带：考马斯亮蓝色染色条带和银染色条带清晰可见。
质谱样品制备的注意事项：
样品制备过程应避免各类污染和反复冻融。
在制备和切割凝胶时避免角蛋白污染。使用专用凝胶试剂和干净的一次性切割工具。
对于蛋白质考马斯亮蓝染色，肉眼可见的量一般可以通过质谱鉴定。
银染蛋白质不能使用戊二醛作为固定剂，因为戊二醛引起的蛋白质不可逆交联会影响质谱鉴定结果。
质谱的应用
蛋白质纯度分析和蛋白质质量测定
MALDI-TOF是一种软电离技术，可用于检测目标蛋白或多肽的存在与否、二聚体的存在以及纯度的一般评估。MALDI-TOF鉴定的分子量范围很广。可以鉴定Da蛋白质分子量，准确度高达0.1%至0.01%，远远高于目前常规的SDS电泳和高效凝胶色谱技术。
肽质量指纹图谱（PMF）
PMF是通过特定切割位点对蛋白质进行水解后获得的肽片段的质量图谱。由于每种蛋白质的氨基酸序列（一级结构）不同，当蛋白质水解时，得到的肽片段序列也不同。因此，肽质量指纹图谱也是独特的。通过将肽图谱与数据库中的蛋白质理论图谱进行比较，鉴定蛋白质的身份。因此，分子量的准确性是PMF的关键指标，但蛋白质的翻译后修饰可能使PMF的质量与理论值不一致，从而影响蛋白质鉴定的准确性。
MS/MS串联质谱测序
串联质谱（MS/MS）是目前zuì常用的质谱鉴定方法。MS/MS首先通过质谱确定肽质量，然后选择高丰度肽进行二次质谱分析。二次质谱中的肽相互碰撞，导致氨基酸键断裂，产生肽碎片离子，被检测器检测到。这样，筛选肽的氨基酸序列信息就得到了。MS/MS利用肽片段富集的准确质量信息，特异性和可靠性更高，可以大大提高数据库检索的可靠性。
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