一、准备工作
准备工作对开展细胞培养异常重要,工作量也较大,应给予足够的重视,准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行.准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒,培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌,无菌室或超净台的清洁与消毒,培养箱及其他仪器的检查与调试,具体内容可参阅有关文献.
二、取材
在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定),经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养皿中,这一过程称为取材.如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程.机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养.
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养,实际上幼体组织(尤其是胚胎组织)比成年个体的组织容易培养,分化程度低的组织比分化高的容易培养,肿瘤组织比正常组织容易培养.取材后应立即处理,尽快培养,因故不能马上培养时,可将组织块切成黄豆般大的小块,置4℃的培养液中保存.取组织时应严格保持无菌,同时也要避免接触其他的有害物质.取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌,为减少污染可用抗菌素处理.
由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献.
三、培养
将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养.如系组织块培养,则直接将组织块接入培养器皿底部,几个小时后组织块可贴牢在底部,再加入培养基.如系细胞培养,一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数,按要求以一定的量(以每毫升细胞数表示)接入培养器皿并直接加入培养基.细胞进入培养器皿后,立即放入培养箱中,使细胞尽早进入生长状态.
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次,观察的内容包括细胞是否生长良好,形态是否正常,有无污染,培养基的PH是否太酸或太碱(由酚红指示剂指示),此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查.
一般原代培养进入培养后有一段潜伏期(数小时到数十天不等),在潜伏期细胞一般不分裂,但可贴壁和游走.过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期.细胞长满瓶底后要进行传代培养,将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养.每传代一次称为“一代”.二倍体细胞一般只能传几十代,而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去.转化细胞可能具有恶性性质,也可能仅有不死性(Immortality)而无恶性.
培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料.
四、冻存及复苏
为了保存细胞,特别是不易获得的突变型细胞或细胞株,要将细胞冻存.冻存的温度一般用液氮的温度－196℃,将细胞收集至冻存管中加入含保护剂(一般为二甲亚砜或甘油)的培养基,以一定的冷却速度冻存,终保存于液氮中.在极低的温度下,细胞保存的时间几乎是无限的.
复苏一般采用快融方法,即从液氮中取出冻存管后,立即放入37℃水中,使之在一分钟内迅速融解.然后将细胞转入培养器皿中进行培养.
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响.